Es werden authentische Tannen- und Fichten-Honigtauhonige mehrerer Jahre aus eindeutig geographischen Regionen, weitere definierte Honigtauhonige Inland (Universität Hohenheim) sowie Ausland (Intertek Food Services GmbH) analysiert. Außerdem werden Honigtau (Universitäten Hohenheim und Wuppertal) und Phloemsäfte (Universität Wuppertal, und eventuell eigene Versuche der Gewinnung) untersucht, für die allerdings die Methode aufgrund der geringen zur Verfügung stehenden Probenmengen verändert werden muss. Die Identifizierung der phenolischen Verbindungen erfolgt über Retentionszeit, UV- und Massenspektrum im Vergleich mit den im Arbeitskreis vorhandenen Standardsubstanzen.

Dieselben o.g. Proben werden hinsichtlich ihrer flüchtigen Verbindungen analysiert. Auch hier ist eine Anpassung der Methode an die deutlich geringere Probenmenge erforderlich. Die flüchtigen Verbindungen werden zunächst anhand ihrer Massenspektren über einen Vergleich mit der NIST-Datenbank und mit Retentionsindices aus der Literatur verglichen und dann über im Arbeitskreis vorhandene oder zu erwerbende Standardsubstanzen identifiziert.

Über einen intensiven Vergleich der Chromatogramme innerhalb einer Honigsorte sowie mit anderen Honigtauhonigen und Blütenhonigen werden aufgrund des alleinigen Vorkommens von Verbindungen oder besonders hohen Intensitäten einzelner Substanzen potentielle Marker für die jeweiligen Honigtauhonige herausgearbeitet. Dies wird sowohl für die Chromatogramme der nichtflüchtigen phenolischen Verbindungen als auch für die Chromatogramme der Aromaverbindungen durchgeführt.

Für die Nutzung einzelner Verbindungen als Markersubstanzen müssen diese sich als stabil erweisen. Über einen Zeitraum von sechs Monaten werden dazu die im Projekt vorgesehenen Honige unter unterschiedlichen definierten Bedingungen gelagert. Die Lagerung erfolgt im Dunkeln und im Hellen bei Raumtemperatur (ca. 20 °C) und, um eine beschleunigte Alterung zu simulieren, werden zudem Honigproben bei ca. 40 °C gelagert. Erweisen sich die potentiellen Markerverbindungen nach den Analysen als stabil, werden sie als Markersubstanzen für die einzelnen Honigsorten definiert.

Die Eignung der potentiellen Markersubstanzen (flüchtige und nichtflüchtige Verbindungen) wird mit Hilfe von Signifikanztests und Hauptkomponentenanalyse überprüft. Damit sind dann die Marker für die jeweiligen Honige etabliert, und es wird eine klare Differenzierung von Honigtauhonigen, besonders der Tannen- und Fichtenhonige, erreicht.

Die Signale von den unbekannten nichtflüchtigen Markerverbindungen in den UHPLC-DAD-Chromatogrammen müssen mit semi-präparativer HPLC isoliert und angereichert werden, bis von den einzelnen Substanzen ca. 10 mg vorliegen, die für die sich anschließende Strukturaufklärung mit Kernresonanzspektroskopie (NMR) erforderlich sind. Dazu müssen die analytischen Trennbedingungen auf die semi-präparative HPLC übertragen werden. Da die Trennleistung einer semi-präparativen Säule nicht mit einer UHPLC-Säule zu vergleichen ist, wird es zu Überlagerungen von Substanzen kommen, die weitere zeitaufwändige Nachfraktionierungen erfordern.
Zum Clean-up vor der semi-präparativen HPLC wird die Honiglösung wegen der größeren aufzuarbeitenden Menge nicht mit SPE-Kartuschen von den die Analytik störenden Zuckern befreit, sondern es wird eine Flüssig/Flüssigextraktion mit Lösungsmitteln vorangesetzt. Es ist davon auszugehen, dass insgesamt mehrere Kilogramm einzelner Honigtauhonige aufgearbeitet werden müssen.
Voraussetzung für eine Identifizierung mit NMR sind weitere Strukturhinweise. Diese können durch zusätzliche Analysen erhalten werden:
- durch Aufnahme von Spektren mit LC-MS/MS
- durch Aufnahme von GC/MS-Spektren durch „normale“ Flüssig-Injektion vor und nach Derivatisierung. Wichtige Hinweise können auch durch Verwendung von GC-Trennsäulen unterschiedlicher Polarität (FFAP, HP-5MS) erzielt werden.
Die isolierten Substanzen, die in ihrer Reinheit durch NMR charakterisiert sein müssen, können dann als Standardsubstanzen der Intertek Food Services GmbH zur Verfügung gestellt werden.

Die Quantifizierung der nichtflüchtigen Marker erfolgt mit der entwickelten SPE-UHPLC-DAD-MS/MS-Methode. Dazu müssen die neuen Verbindungen in die bestehende Methode unter Erfüllung der im SANCO-Dokument an die Analytik geforderten Qualitätsparameter integriert und validiert werden. Die optimierte Methode liefert dann quantitative Ergebnisse, wobei einzelne Verbindungen mit dem DAD, andere massenspektrometrisch im Selected Reaction Monitoring Modus bestimmt werden. Interne, zum Teil auch isotopenmarkierte Standards werden zur Absicherung der quantitativen Daten den Messlösungen zugesetzt.

Durch die Gegenüberstellung der Ergebnisse wird ein statistisches Modell oder Auswerteschema entwickelt, das eine eindeutige Beurteilung und Klassifizierung der einzelnen Honigsorten, besonders der deutschen Tannen- und Fichtenhonige, erlaubt. Angestrebt wird auch eine geographische Abgrenzung von Honigtauhonigen aus Südamerika, Italien, Portugal, Spanien, Griechenland, Türkei und Osteuropa.

Um den Einfluss der Phloemsäfte, der unterschiedlichen Lausarten und der Bienen auf den Honigtauhonig darzulegen, werden unsere Ergebnisse denen der Universität Hohenheim und Wuppertal gegenübergestellt und ausgewertet. Außerdem sollen Markerverbindungen aus dem Bereich der phenolischen Verbindungen oder der Aromakomponenten im Honigtau für den zu erwartenden Melezitosegehalt im Honig erarbeitet werden.